1、作用于细菌体内的核糖体，抑制细菌蛋白质合成，并破坏细菌细胞膜的完整性。敏感菌具有氧依赖性抗生素跨膜转运系统，链霉素可首先经被动扩散通过细胞外膜孔蛋白，然后经此转运系统通过细胞膜进入细胞内，并不可逆地结合到分离的核糖体30S亚基上，导致A位的破坏，进而阻止氨酰tRNA在A位的正确定位，干扰功能性核糖体的组装，抑制70S始动复合的形成。

2、诱导tRNA与mRNA密码三联体错误匹配，引起完整核糖体的30S亚基错读遗传密码，导致异常的、无功能的蛋白质合成。

3、阻碍终止因子与A位结合，使已合成的肽链不能释放，并阻止70S完整核糖体解离

4、阻碍多核糖体的解聚和组装过程，造成细菌体内的核糖体耗竭。